De zusters leefden in de clausuur van het klooster, hetgeen wil zeggen dat het gesloten was voor anderen. De beslotenheid begon in deze ruimte. Onder leiding van één van de oprichtsters mater Alijd Busers en de rector Meester Martijn (tevens priester van de Oude Kerk) bloeide het kloosterleven van de zusters van de Derde Orde van St. Franciscus. De rector moest nieuwe zusters insluiten en de zielzorg (erediensten, toedienen sacramenten) binnen het klooster op zich nemen. Toen Alijd stierf werd ze opgevolgd door haar dochter Aechten. Rond 1550 was Isabella Nicolaasdochter van Grijpskercke mater van het Sint Agathaklooster. In haar tijd werd Cornelis Musius de rector. Hij had in het klooster een eigen woning, vermoedelijk langs de Oude Delft. In die tijd kende het klooster een enorme welvaart en ontving (meestal op kosten van de stad) vele voorname gasten, waaronder Willem van Oranje. Toen Delft zich in 1572 aan de kant van de protestanten schaarde, dook Musius onder bij particulieren. Pas als de Prins in het klooster komt wonen, durft Musius zich weer te vertonen, hoewel hij zich niet gerust voelde aangezien de Geuzenaanvoerder Lumey hem meerdere malen met de dood had bedreigd. Een vluchtpoging van Musius op 10 december 1572 werd hem noodlottig; op bevel van Lumey werd hij opgepakt, gemarteld en aan de galg gehangen in Leiden.
